موضوع: بازسازی غضروف استخوانی با استفاده از نانوکامپوزیت

بیش از ۱۶ میلیون‌نفر در آمریکا از دردهای شدید مفصلی و فقدان حرکت در نتیجه صدمه یا استئوآرتریت رنج می‌برند (آمار ارائه شده توسط انجمن جراحان ارتوپدی آمریکا). رایج‌ترین علت مشکلات مفصلی، تخریب غضروف مفصلی است. غضروف مفصلی ممکن است در اثر سایش، آرتریت یا صدمه در هنگام بارگذاری شدید آسیب ببیند که فرآیند تخریب مکانیکی غضروف مفصلی با از بین رفتن تدریجی ساختار و عملکرد طبیعی غضروف مفصلی همراه است. در صورت ادامه تخریب، پوشش غضروفی مفصل از بین رفته و استئوآرتریت ایجاد می‌گردد. توانائی ترمیم طبیعی غضروفی مفصلی محدودیت دارد، زیرا تنها، سلول‌های زنده در بافت غضروفی (کندروسیت‌ها) دارای توانائی تکثیر هستند. در فاصله سال‌های ۱۹۹۶ تا ۱۹۹۷ حدود ۵۶ درصد درمان‌های اسکلتی ـ ماهیچه‌ای در زانو بوده است (مطابق گزارش انجمن جراحان ارتوپدی آمریکا) که لزوم توسعه درمان مشکلات غضروف مفصلی را تأیید می‌کند، چرا که ترمیم دائمی یا بازسازی غضروف مفصلی در مفاصل دارای تحمل وزن (زنو و هیپ) با استفاده از دیدگاه‌های درمان غیرجراحی و جراحی رایج قابل دستیابی نیست.
● ساختار مفصل
غضروف مفصلی یک بافت فاقد عروق خونی (آواسکولار) است که در مکان‌های مختلف متفاوت است. از یک‌سو خصوصیت الاستیک غضروف به مفصل امکان می‌دهد تا در برابر ضربه مقاوم باشد و از سوی دیگر صیقلی بودن سطح آن امکان انجام حرکات با حداقل اصطکاک را فراهم می‌کند. منحنی تنش کرنش غضروف در بارگذاری ثابت غیرخطی است.
استحکام کشش غضروف پائین (۱۰ـ۱ مگاپاسکال)، مدول فشردگی آن حدود ۱ مگاپاسکال و مدول الاستیک آن ۵/۱ ـ ۳/۰ مگاپاسکال است، هر چند که در محیط بدن انسان در بارگذاری دینامیک مفاصل، استرس‌ها تا ۱۸ مگاپاسکال اندازه‌گیری شده‌اند.
● تکنیک‌های بازسازی غضروف مفصلی
تکنیک‌های رایج برای ترمیم غضروف مفصلی شامل تحریک مغز استخوان، تراشیدن کندرال، استفاده از لیزر جهت کندروپلاستی، کندروپلاستی با استفاده از ایجاد خراشیدگی و پیوندهای پری کندیلار و پریوست است. روش بیولوژیک و مهندسی بافت نیز روش‌های دیگر ترمیم است. روش بیولوژیک شامل انتقال بافت اتولوگ و انتقال کندرال الوژنیک است. استفاده از روش‌های مکانیکی درمانی خیلی کارآمد نیستند، زیرا باعث ایجاد یک بافت فیبروکارتیلاژی می‌شوند که از لحاظ ساختار و پایداری متغیر هستند و در واقع یک درمان بلندمدت محسوب نمی‌شود، به‌طوری‌که در روش کندروپلاستی با لیزر به‌رغم عملکرد عالی غضروف پس از انجام آن، ترمیم تنها برای ۱۲ هفته حفظ می‌شود و با مرگ سلول‌ها و تخریب بافت غضروفی همراه است. علاوه بر این، موفقیت این روش‌ها به سن بیمار و شدت استئوآرتریت وابسته است.
اشکال اصلی در روش‌های بیولوژیک، پس زدن پیوند و افزایش احتمال انتقال هپاتیت و HIV است.
مهندسی بافت مبتنی بر سلول، روش دیگری برای ترمیم غضروف ارائه می‌دهد، به‌طوری‌که در این روش مواد قابل کشت متناسب با نیازمندی‌های غضروف در بدن انسان شناخته می‌شوند و بدون ایجاد پاسخ‌های ایمونولوژیک به بدن انسان پیوند می‌شوند. در بین تکنیک‌های اخیر ترمیم غضروف، مهندسی بافت ثابت کرده است که تلفیق کندروسی‌ها با داربست متخلخل قابل تجزیه از طریق فرآیندهای بیولوژیک می‌تواند رویکرد آینده ترمیم غضروف گردد.
● انتخاب مواد
مهم‌ترین مشخصه‌های مورد ملاحظه برای انتخاب مواد به‌عنوان داربست، قابلیت سازگاری با محیط بدن انسان، قابلیت اتصال، غیرسمی بودن و به همراه نداشتن پاسخ ایمونولوژیک است. علاوه بر موارد ذکر شده، مواد انتخابی باید طی فرآیند ترمیم، خصوصیات مکانیکی، شیمیائی و بیولوژیک مناسب برای بافت را فراهم کنند و در نهایت باید از لحاظ قیمت به صرفه باشند. با توجه به این نکته که غضروف تحت شرایط مختلفی بارگذاری می‌شود، لازم است تا تنش در مکان ترمیم قبل از انتخاب مواد مناسب تحلیل شود. همچنین ساختار داربست باید فضای کافی برای رشد کندروسیت‌ها و سطح کافی برای اتصال سلول‌ها را داشته باشند یا فاقد این قابلیت باشند. نوع قابل تجزیه برای کاربردهای کوتاه‌مدت و نوع غیر قابل تجزیه جهت کاربردهای بلندمدت (مانند تعویض هیپ) مورد استفاده قرار می‌گیرد. استفاده از مواد با قابلیت تجزیه در بدن انسان ترجیح دارد، زیرا مواد فاقد این قابلیت در بلندمدت، ذرات بسیارریزی را در اثر فرسایش طی گذشت زمان ایجاد می‌کنند که برای بدن مضر است. از داربست‌های پلیمری برای پر کردن نقص‌های استخوان استفاده می‌شود تا با پوشش ناحیه آسیب‌دیده سطح مفصلی ثبات یابد و در دوره بازسازی خصوصیات فیزیکی و مکانیکی غضروف مفصلی حفظ شود.
ماتریس خارج سلولی از کلاژن نوع دوم و پروتئوگلیکان‌ها ساخته شده است که یک شبکه (Mesh) فیبروزی را می‌سازد، لذا اگر لازم است داربست‌های فیبروزی نیز ساختار مشابه ماتریس خارج سلولی داشته باشند که توسط یک شبکه پلیمری فیبروزی فراهم می‌شود.
در مهندسی بافت تاکنون از چندین نوع داربست پلیمری استفاده شده که در محیط بدن انسان و آزمایشگاه بررسی شده‌اند. در این مطالعات از پلیمرهای دارای قابلیت جذب در بدن انسان مانند پلی اسید گلیکولیک (PGA)، پلی اسید لاکتیک (PLA) و کوپلیمر آنها PLGA) Poly DL-lactic-co-glycolic acid)، علاوه بر پلیمرهای قابل جذب طبیعی مانند کلاژن، ژلاتین، فیبرین و آلژینات به شکل شبکه اسفنجی، فیبر و ژل استفاده شده است.
پیشنهاد شده است که کندروسیت‌ها با PLA تنیده نشده سازگارتر از PGA تنیده نشده هستند. PLA نسبت به PGA هیـدروفیل‌تـر اسـت کـه به‌عـلت وجـود گـروه متیـل در آن است و نـرخ هیدرولیـز PLA نسبـت بـه PGA آهسته‌تـر اسـت. زمان تجزیه PLA در بدن انسان به اندازه‌ای است که بافت، ترمیم شده و عملکرد مناسب را به‌دست آورد. به این دلیل PLLA) Poly-L-Lactic acid) به‌عنوان پلیمر پایه استفاده شده است.
● ساخت داربست پلیمری
از بین روش‌های مختلف، روش Electrospining برای ساخت داربست فیبروزی استفاده می‌گردد که در آن از یک محلول پلیمری شامل حل یک پلیمر منفرد یا ترکیبی از پلیمرها در یک حلال استفاده شده که در معرض اثر الکتریکی قرار داده می‌شود. حلال طی این فرآیند تبخیر شده و فیبرهای پلیمری خشک جمع‌آوری می‌شوند. ماتریس تشکیل شده به این روش سه بعدی، شدیداً متخلخل، فیبروزی و دارای ساختار نامنظم است. مواد تقویت‌کننده از قبیل تیوب‌های کربنی (CNT) نیز می‌توانند به یک‌چنین ماتریسی به‌وسیله Co-electrospining اضافه شوند.
● فرضیات
جهت انجام این مطالعه چندین فرضیه تعریف شده است که به شرح زیر هستند:
۱. وجود SWNT در داربست پلیمری خصوصیات مکانیکی را بهبود می‌بخشد.
۲. ساختار نانوفیبروزی به اتصال سلول و تکثیر آنها کمک می‌کند.
هدف ویژه مطرح شده در این مطالعه، بررسی خصوصیات مکانیکی co-electrospin PLLA با SWNT است.
● روش بررسی
چهار نوع داربست زیر تهیه شدند و با هم مقایسه شدند:
۱. (PLLA (P
۲. (PLLA/-PL (PK
۳. (PLA/SWNT (PC
۴. (PLLA/SWNT/-PL (PKC
غلظت PLLA در تمامی محلول‌ها ۵/۲ درصد بود. SWNT تحت فرآیند ته‌نشینی منواکسید کربن با فشار بالا به آن اضافه شد. SWNTها برای مدت ۴ ساعت در دمای ۱۳۰ درجه سانتی‌گراد خشک شدند و سپس در دی‌متیل فرمامید (DMF) به‌صورت یکنواخت توزیع شدند. پلیمر در حلال کلروفرم (CHCL۳) توسط گرما و هم‌زدن به‌طور یکنواخت حل شد. چهارنوع داربست ساخته شده با استفاده از تکنیک الکترواسپاینینگ (Electrospining) ساخته شدند. از تست‌های کششی برای تعیین خصوصیات مکانیکی مانند حداکثر تنش، مدول الاستیک و طول در هنگام از هم گسستگی استفاده شد. در هر چهار نوع داربست دارای کلاژن، کندروسیت‌های انسانی کشت شدند و برای مدت ۹ هفته در زمان‌های مختلف مورد مطالعه قرار گرفتند و مشخصه‌های آنها با میکروسکوپ الکترونی (ESEM) و میکروسکوپ الکترون انتقالی (TEM) بررسی شد. اسپکتروسکوپی ”رامن“ بر اساس اثر ”رامن“ است که با آن طول موج و شدت نور تابیده شده از مولکول‌ها اندازه‌گیری می‌شود. برای مشخص کردن وجود SWNTها در سیستم الکترواسپان (electrospun PC) و داربست‌های PK، تحلیل اسپکتروسکوپی ”رامن“ انجام شد. طول موج القائی ۷۸۰ نانومتر و دانسیته قدرت ۱۲ وات بر سانتی‌متر مربع بود. ”طیف رامن“ (Raman Spectra) برای نانوتیوب‌ها دارای پیک نزدیک به Cm-۱۸۰ بود که باند بین پیک‌ها ۱۶۰۰ـ۱۵۰۰ سانتی‌متر مطابق با فرکانس گرافیت بود. برای تعیین خصوصیات مکانیکی ۴ نمونه داربست (P , PK , PC , PKC) به ابعاد ۴۰٭۵ میلی‌متر از دستگاه میکروتنسایل استفاده شد (Kawabata KES-G۱ Microtensile Tester). نرخ تنش ۲ میلی‌متر در ثانیه بود که نمودار بار و تغییر شکل‌ها بر این اساس رسم شدند.
● نتایج
نتایج خواص فیزیکی و مکانیکی داربست
با بررسی تصاویر ESEM چهار نمونه داربست P , PC , PK , PKC مشخص شد که دامنه قطر فیبرها از ۱۵۰ نانومتر تا ۱ میکرمتر با متوسط قطر ۵۰۰ نانومتر (با انحراف استاندارد تقریباً ۱۶۰ نانومتر) است. نمودارهای توزیع فیبر، یک توزیع گوسی را نشان می‌دهد. تصاویر TEM بیان‌گر موقعیت نانوتیوب‌های کربنی در فیبرها هستند. در داربست PC، نانوتیوب‌ها در راستای قرارگیری فیبرها هستند و در خارج فیبر امتداد یافته‌اند. دو نانوتیوب در اتصال با یکدیگر و در کنار هم هستند. در تصاویر به‌دست آمده، دسته‌هائی به ضخامت ۱۰ نانومتر قابل تشخیص است که هر یک شامل ۵ تا ۱۰ نانوتیوب به قطر ۱ تا ۲ نانومتر هستند.
در PKC، نانوتیوب‌ها در راستای فیبرها بوده، اما به سمت خارج فیبرها امتداد نیافته‌اند. بنابراین می‌توان نتیجه‌گرفت که در داربست‌های PKC و PC نانوتیوب‌ها در راستای فیبرها هستند و در تعیین ویژگی کریستالی ماتریس پلیمری فیبروزی نقش دارند.
در بررسی اسپکتروسکوپی ”رامن“ جهت تعیین وجود نانوتیوب‌ها در داربست‌های P , PK , PC و PKC معلوم شد که در داربست PC و PKC نانوتیوب‌ها وجود دارند، اما در داربست‌های P و PK پیک نمودار برای تأیید وجود گرافیت یا نانوتیوب دیده نشد.
برای محاسبه قطر نانوتیوب‌ها از پیک‌های RBM استفاده شد که در آن فرکانس RBM با قطر نانوتیوب رابطه عکس دارد.
پیک‌ها در RBM در ۲۶۷، ۲۲۷ و ۲۰۹ سانتی‌متر بودند و متوسط قطر نانوتیوب با استفاده از این روش ۱۲/۰ تا ۹۷/۰ نانومتر اندازه‌گیری شد.
برای بررسی خصوصیات مکانیکی، سه نمونه از هر داربست تهیه شد و خصوصیات مکانیکی آنها مانند مدول و استحکام کششی محاسبه شدند که نمودارها همگی تا نقطه از هم‌گسیختگی خطی هستند.
در نمونه‌های PK افزایش طول آنها از نمونه P بیشتر است و در برابر تنش مقاوم‌تر است. هر چند که مدول آن کمی پائین‌تر است، اما اختلاف محسوسی با یکدیگر ندارند. نمودار کرنش غیرخطی بود.
نمونه PC، الاستیسیته کم‌تر از نمونه P دارد، اما در برابر تنش، مقاومت آن بالاتر است و مدول آن سه برابر مدول نمونه P است. بنابراین نانوتیوب‌ها خصوصیات مکانیکی داربست پلیمری را بهبود داده‌اند. برای نموه PC نمودار تنش کرنش دارای دو ناحیه مجزا است، به‌گونه‌ای که مدول قسمت اولیه بسیار بالا (شیب زیاد) و در قسمت دوم نمودار شیب کم‌تر و ثابت است. در نمونه PKC، مقاومت آن در برابر تنش بیشتر و مدول آن تقریباً ۵/۲ برابر نمونه PK است، اما نسبت به نمونه PC کمی پائین‌تر است. نمودار تنش کرنش در ابتدا مدول بالا و در ادامه مدول پائین و ثابت است.
تست‌های کششی نشان می‌دهند که داربست همراه با نانوتیوب، مقاومت بیشتری در برابر تنش در مقایسه با داربست تقویت نشده از خود نشان می‌دهد. با توجه به اینکه مفصل در معرض تنش‌های مختلفی است، حداکثر تنش بالا و مدول PKC باعث می‌شود که این نوع داربست برای استفاده در بدن انسان به منظور ترمیم غضروف مناسب‌تر باشد.
● نتایج مربوط به تعامل داربست‌ها با ماتریس سلولی
داربست‌های دارای سلول‌های انسانی در زمان‌های مختلف (۱۰ روز، ۳ هفته، ۶ هفته و ۹ هفته) تصویربرداری شدند. تصاویر ESEM مربوط به ۱۰ روز بعد کشت کندروسیت‌ها نشان می‌دهند که کندروسیت‌ها در ماتریس خارج سلولی هر چهار نمونه رشد کرده‌اند. تصاویر در ۳ هفته بعد، رشد کندروسیت‌ها را به‌صورت مشابه در داخل داربست هر چهار نمونه، در راستای فیبرها را نشان می‌دهند. به‌نظر می‌رسد در این مرحله ماتریس در حال پر کردن منافذ است.
۶ هفته بعد کندروسیت‌ها هنوز وجود دارند و سطح فوقانی داربست‌های P , PK و PKC را پوشانده‌اند در حالی‌که کندروسیت‌ها سطح فوقانی داربست PC را به‌طور کامل نپوشانده‌اند، در پایان ۹ هفته برای نمونه‌های P , PK و PKC دیگر داربست فیبروزی دیده نمی‌شود و کاملاً با کندروسیت‌ها پوشانده شده‌اند. در نمونه PC اتصالات کم‌تر، اما سلول‌ها زنده هستند که این امر ثابت می‌کند که SWNT بر رشد سلولی تأثیر منفی ندارد. نمونه PKC دارای تعداد زیادی SWNT است که به‌خوبی با کندروسیت‌ها تعامل دارد. این امر بیانگر غیرسمی بودن آنها و نداشتن اثر منفی بر زنده ماندن سلول‌ها است.
● بحث و نتیجه‌گیری
نتایج نشان دادند که داربست دارای SWNT مدولی حدود ۱۲۵ مگاپاسکال دارد که ۵/۲ برابر داربست بدون تقویت است. همچنین بررسی‌ها ثابت کردند که ساختار نانوفیبروزی الکترواسپان به اتصالات سلولی و تکثیر آنها کمک می‌کنند. با توجه به این مطلب که در پایان ۹ هفته در چهارنمونه سلول‌ها زنده بودند، مشخص می‌شود که ترکیب داربست اسیدال‌لاکتیک، PL (PKC) , SWNTـ تعامل مناسبی با کندروسیت‌ها دارد و نه تنها بر حیات کندروسیت‌ها تأثیر منفی ندارد، بلکه باعث افزایش ویژگی‌های مکانیکی به‌صورت محسوس می‌گردد.
هنوز مطالعات بیشتری در این زمینه مورد نیاز است تا رفتار واقعی داربست در مکان ایمپلنت بررسی شود. چالش اصلی در کاربرد بیومواد در بازسازی بافت‌ها این است که در حد فاصل ایمپلنت از هم گسیختگی وجود دارد که این امر می‌تواند در ارتباط با بازسازی غضروف باشد. نتایج بلندمدت داربست کامپوزیت هنوز ناشناخته است، به‌طوری‌که بیشتر آنها هنوز مراحل تکاملی را سپری می‌کنند.